转自：药时空
Treg 即调节性 T 细胞（Regulatory T cells），是 T 细胞的一个特殊亚群，其作用是抑制免疫反应，从而维持体内平衡和自我耐受。研究表明，Tregs 能够抑制 T 细胞增殖和细胞因子的产生，并在预防自身免疫中发挥关键作用。如同其他 T 细胞类型，Treg 细胞也存在不同的亚群，不同的 Treg 亚群具有不同的功能。Treg 通常可以通过流式细胞术来识别，其最特异的标记物是位于细胞核内的转录因子 FoxP3。在常规临床实践中，人们会通过 CD25high (高分子密度)和 CD127low (低分子密度) 等表面标记物作为替代标记物检测 Tregs。
Treg 细胞的数量或功能的失调，均可能导致自身免疫性疾病。因此，治疗性调节 Treg 被认为是一种很有前途的治疗方法，可用于治疗过敏等特定疾病，也可用于防止同种异体移植排斥反应。此外，鉴于 Treg 在抑制抗肿瘤免疫应答中发挥着重要作用，近年来已经成为肿瘤免疫治疗中一个颇有吸引力的干预靶标。然而，系统性地靶向 Treg 也会破坏免疫平衡，导致自身免疫性损伤或自身免疫性疾病。
研究人员首先收集了 36例胶质母细胞瘤（GBM）、膀胱腺癌(BLCA)、透明细胞肾癌（ccRCC）和前列腺腺癌（PCa）患者自身的匹配的肿瘤和血液样本，这些癌症类型的匹配数据在现有数据集中较少出现。利用流式细胞术，作者对 TI-Tregs 和 P-Tregs、外周血 CD4+ 和 CD8+ T 细胞以及肿瘤浸润性 CD8+ T 细胞进行了分类分析。作者还收集了初始外周血 CD4+ 和 CD8+ T 细胞，并在体外进行刺激与激活，作为额外的激活对照。然后，作者对样本进行了 RNA-seq，并使用 ARACNe 和 VIPER 算法分别生成 TI-Treg 特异性基因调控网络和评估差异蛋白活性。基于蛋白活性的聚类分析，作者发现了一个独特的肿瘤浸润性 T 细胞簇。有趣的是，TI-Tregs 被发现具有相对于肿瘤类型无关的转录状态。虽然基因表达数据本身无法区分 TI-Tregs 和 P-Tregs，但对转录靶点表达差异最大的候选 MRs 的分析，几乎可以完美地分层所有肿瘤类型的 TI-Tregs 和 P-Tregs。
接下来，研究小组使用随机森林算法在 TI-Tregs 差异表达中识别出 15个最具歧视性的候选 MRs。7个候选 MRs 也被确定为 TI-Tregs 与其他对照亚群的最佳分类，其中 2个未包括在先前确定的候选 MRs 中。
为了验证总共 17个候选 TI-Treg MRs，其中许多已知在 Treg 功能或抑制性 T 细胞活化中起作用。研究人员使用体外过表达试验，确定了是否有任何单个 MRs 就可以诱导幼稚 P-Treg 进入 TI-Treg 状态。在 scRNAseq 和无监督聚类之后，研究人员发现了一个富含 TI-Treg 特征的细胞簇，其中包括所有 17个候选 TI-Treg 基因。分析显示，17个候选 MRs 中有 11个足以诱导 MR 模块的变化，并将整体转录特征转移到 TI-Tregs，所有 MRs 在单细胞水平上同时活跃。在所有候选 MRs 中，FOSL2 和 TRPS1 的富集度最高。
为了在体内验证 MRs 的功能，作者使用 CHIME 小鼠模型进行了 CRISPR-Cas9 筛选，并评估免疫细胞谱系特异性敲除 MRs 是否可以在不影响 P-Tregs 的情况下消耗 TI-Tregs。在具有 HSC 重建的免疫系统的 Cas9 耐受小鼠中，大多数诱导的 Treg 只携带单个 sgRNA。结直肠癌细胞 MC38 植入小鼠之后，阳性对照基因在 Tregs 中的删除正如预测，而且 8个 MRs 在 TI-Tregs 和 P-Tregs 中均表现出显著的 sgRNA 缺失。其中，5个肿瘤细胞的 TI-Tregs 相对于传统 CD4+ T 细胞也出现显著减少。与体外模型一样，统计学上最显著的蛋白是 Trps1。
为了研究 Trps1 的作用，研究人员在造血谱系中利用 CRISPR 对 Trps1 进行了条件敲除（cKO）。在携带 MCA205 肿瘤的 CHIME 小鼠中，Trps1 敲除在53.8%（7/13） 的小鼠中诱导自发而持久的肿瘤排斥反应，该组小鼠相比于对照组表现出显著的生存优势。重要的是与对照 sgRNAs 相比，含有 Trps1-sgRNAs 的 Treg 在体外的抑制能力实验没有表现出统计学意义上的显著下降，并且在外周组织中没有观察到自身免疫或免疫病理迹象，这表明 Trps1 与肿瘤特异性相关，它有助于获得和维持更具抑制性的 Treg 表型。
鉴于 Trps1 在 TI-Treg 中是一个重要的 MR,作者通过进行全身药物筛选，作者研究了 TI-Treg 通路的治疗靶向潜力。对患者来源的体外扩增的 TI-Treg，作者用 1554个 FDA 批准的或正在研究的化合物库进行治疗性筛选。从 195种抑制 Treg 生物活性超过 60%的化合物中，研究人员选择了那些在 48小时内最大亚致死剂量最低的化合物，并评估了每种药物在最低致死剂量下的扰动效果。在评估了多个指标之后，研究人员确定吉西他滨是靶向 TRPS1 和抑制 TI-Tregs 的首选候选药物，包括基于对 17-MR Treg 标记的抑制，TI-Tregs 与 P-Tregs 的体外消耗，oncoTreat 预测，剂量依赖效应的一致性以及许多其他因素。
研究人员进一步研究了吉西他滨的免疫调节作用，并发现在患有晚期 MC38 肿瘤(抗 PD-1) 的小鼠中，低剂量吉西他滨 (约为小鼠临床相关剂量的 1/10) 即可暂时控制 MC38 进展并延长小鼠的生存期。此外，低剂量吉西他滨可使小鼠对抗 PD-1 治疗的敏感性增加，联合用药可在 50%的小鼠中诱导完全缓解，并且比 PD-1 单药治疗进一步延长了小鼠的生存期。这种作用至少有一部分是免疫效应介导的，因为低剂量吉西他滨在免疫功能正常的小鼠中比在 NSG 小鼠中表现出更强的效应。低剂量吉西他滨就足以使小鼠对抗 PD-1 治疗更敏感，并实现完全应答和提高小鼠的生存率。在较高剂量下，吉西他滨在免疫正常小鼠和 NSG 小鼠中的差异效应则会因为细胞毒性效应而被掩盖。
在携带 MC38 肿瘤的小鼠中，在吉西他滨治疗后肿瘤中的 Tregs 是唯一出现绝对数量减少的亚群，而脾脏 Tregs 没有减少。这种作用不是由于 Treg 在肿瘤中的增殖减少，而是由于抑制了以 Helios 和 CD103 表达为特征的高度抑制性 Treg 亚群。基于蛋白质活性的聚类分析显示，一个聚类对先前鉴定的人类 TI-Treg MRs 具有高度富集，包括 TRPS1。该簇 Helios 的表达也最高，在肿瘤中比在脾脏中更普遍，并且在吉西他滨治疗后强烈降低，表明吉西他滨靶向 TI-Treg MR 活性。
总体而言，Obradovic 等人发现并验证了区分 TI-Tregs 和 P-Tregs 的 MR 特征，并确定吉西他宾是一种可以特异性靶向 TI-Tregs 的低剂量的药物，并可使小鼠对免疫治疗增敏。这一发现可在临床上提供设计合理的联合疗法，增强免疫治疗的疗效。这种方法的普遍性也允许在未来识别和靶向其他免疫抑制亚群中的 MR 蛋白。
参考资料：
1. Obradovic A, Ager C, Turunen M, Nirschl T, Khosravi-Maharlooei M, Iuga A, Jackson CM, Yegnasubramanian S, Tomassoni L, Fernandez EC, McCann P, Rogava M, DeMarzo AM, Kochel CM, Allaf M, Bivalacqua T, Lim M, Realubit R, Karan C, Drake CG, Califano A. Systematic elucidation and pharmacological targeting of tumor-infiltrating regulatory T cell master regulators. Cancer Cell. 2023 Apr 25.
2. https://acir.org/weekly-digests/2023/may/targeting-tregs-but-only-in-the-tumor